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溶源性细菌的检查与鉴定!

小杨 / 2019-09-28

正文


一、原理

细菌染色体上整合有前噬菌体(或称原噬菌体)并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌,称为溶源性细菌。溶源性细菌在自然界中普遍存在,而且自发裂解,释放温和噬菌体,但频率较低(10-2~105)物理方法(如紫外线和高温)和化学方法(如丝裂霉素C)可诱导大部分溶源菌裂解并释放温和噬菌体。溶源性细菌对同一种或关系密切的噬菌体具有免疫性,因此对于溶源菌的检查必须有相应的敏感菌株才能确定,敏感菌株对以从待检的溶源菌株相近的种或变种或不同菌株中找到。

溶源性细菌裂解释放噬菌体,会给发酵工业带来威胁,溶源性细菌使宿主细胞发生溶源转变,不仅可以保护溶源菌免受同源噬菌体的再感染,还会赋予宿主细胞新的特性,温和噬菌体已被广泛用于转导、基因工程载体和分子生物学等领域。本实验采用诱导方法使溶源细菌裂解.再用敏感菌双层平板法检测诱导后噬菌体释放数目的增加,从而确认细菌的溶源性。

二、材料

⒈样品 待检菌——大肠杆菌225 (λ),敏感菌——大肠杆菌226。

⒉培养基及药品和试剂 LB固体、半固体和液体培养基,1%蛋白胨,100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)缓冲液或生理盐水,氯仿,0.2%柠檬酸钠溶液。

⒊设备 水浴箱、台式离心机、紫外光灯、摇床等。

⒋器皿及其他 试管、培养皿、三角瓶、吸管,离心管、滤膜、滤膜滤菌器等。

三、方法与步骤

本实验采用紫外线处理诱导溶源菌裂解,未经诱导处理的溶源菌菌悬液做对照。

⒈溶源菌培养 将经LB斜面活化的大肠杆菌225(λ),接种于装有20mlLB培养液的250ml三角瓶内,30℃振荡培养16h,再从中取2ml菌悬液接入另装有20ml LB培养液的250ml三角瓶内,37℃振荡培养2h至对数期。

⒉排除游离噬菌体 如待检菌株为芽孢杆菌,可先制成孢子悬液,再经80℃ 10min处理,杀死溶源菌表面可能吸附的及游离的噬菌体;如待检菌抹为非芽孢杆菌,可利用噬菌体制备的抗血清或0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞,除去表面吸附的及游离的噬菌体。然后经4000r/min离心10min,上清液可加人敏感指示菌做双层平板测定,用于检验样品屮足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬菌体,离心后的菌体细胞进行诱导处理。

⒊诱导溶源菌 离心后收集的菌体用无菌生理盐水洗涤两次,用生理盐水或100mmol/l Tris-HCL缓冲液(pH7.0)制成终浓度为1011个/ml细胞的菌悬液,每皿加5ml菌悬液,经紫外灯30W,距离30cm、照射30s,立即加入5ml双倍浓度的LB培养液,混匀后37℃黑暗中培养2h。

⒋溶源性菌株检查 按双层琼脂法操作,取上述诱导裂解液加入几滴氯仿,以10倍稀释法适当稀释,选择后3个稀释度的稀释液,毎个稀释液取0.3ml与0.2ml对数期敏感大肠杆菌226菌悬液混匀,再加入融化后冷却至45℃的LB半体培养基,立即混匀,随即倾入LB固体培养基平板上,待凝固后,37℃培养6h观察。经过培养的平板如果有大量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。

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