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用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率!

小杨 / 2019-09-29

正文


平板计数琼酯(Plate Count Agar,PCA)是用来检测饮用水中异养菌(Heterotrophic Plate Count,HPC)的常用培养基,其营养含量高,历史上应用最广泛。但从2O世纪7O年代末开始,越来越多的检测证实,采用PCA 将明显低估了异养菌的真实数量,根据PCA计数结果来评价水处理的有效性及管网的清洁、卫生程度并不可靠,饮用水的致病风险很可能较预期高得多。提高检测技术的灵敏度,获得尽可能高的计数仍应视为饮用水微生物学研究的重要内容。

一、HPC结果偏低的原因分析
PCA等培养基可能只检出了水样细菌总数中很少的一部分,其他未检出细菌根本就不能在检测环境中生长,或者生长相对缓慢,在设定时间内不能形成可见菌落。

⒈细菌存活但不能被检出
弧菌(Vibrio)、埃希氏菌(Eschericha)、沙门氏菌(Salmonella)、气单胞菌(Aeromonas)、弯曲杆菌(Campylobacter)、志贺氏菌(Shigella)等都被证实存在具有生命活性但不能被培养检出。在培养基平板上,这些细菌不能形成可见菌落,但存活直接培养表明它们具有代谢活力。显而易见,常规检测技术遗漏了这些细菌,造成结果报告偏低。这也可用来解释发生军团菌流行病时,往往不能从水样中检出侵肺军团菌(Legionella pneumophila)等致病菌的现象。

⒉培养基的选择性
由于细菌生理、生化特征的多样性、没有哪种培养基可将水样中的存活细菌全部检出,每种培养基都趋向于只计数适应该种营养条件的一类细菌。如果某种培养基的选择性弱,则其可检出更大量的细菌。
用目前可利用的几种培养基检测相同水样,计数结果往往有显着差异,表明这些培养基都具有较强的选择性。此外,由于对出厂水或管网水进行了消毒处理,只有少数优势种才能存活、繁殖,培养基选择对其能否被检出影响相当大,有的培养基可能根本就不支持这些优势种的生长,有的则比较正常。

⒊培养方法的固有缺陷
用倾倒平皿检测法,培养基平板上生长起来的菌落可能起源于单个或多个细菌。如果是多个细菌团聚在一起,或者多个细菌同时粘附到某个无机或有机颗粒物表面,而水样前处理,主要是人工或机械混匀,不能使团聚或粘附细菌彼此分离,则最终只能形成一个菌落,必然导致对总数量的低估。

⒋细菌的胁迫受损与再生长
消毒不充分或样水保存不当都可能使细菌处于亚致死的受损状态。这些结构或代谢受损的细菌不能在含有表面活性剂的选择性培养基上生长并形成菌落。然而,进入管网后,受损细菌可能完成恢复性生长,以致管网末梢水中细菌的检出量高于出厂水。由于表面的物理保护作用,颗粒物,包括颗粒活性碳(GAC),往往成为受损菌的重要载体n]。种源菌在管网内繁殖再生长,带来的不利影响包括:(1)产生异臭异味;(2)微生物腐蚀管道内壁;(3)干扰对大肠菌的检测;(4)消毒剂残余量低或失效期间的健康风险,如假单胞菌(Pseudomones)、莫拉氏菌(Moraxella)或黄杆菌(Flavobacterium)等的致病作用。环境温度、水中可生物降解有机物的含量、水流速度、水体浊度、管网中消毒剂残余量等控制受损菌的再生长程度。
倾倒平皿检测法使细菌遭受热冲击,受损菌可能不能在检测期内修复生长,导致少计。
有机物组成广泛但含量低的培养基有利于受损菌修复生长。为更真实地检出水中细菌的数量,适当调整培养基组成是必要的。

二、提高HPC计数结果的途径
使用PCA培养基,用倾倒法检测水中细菌总数的技术稳定,但由于PCA具有选择性,而且不能检出产色素菌,因此降低了反映真实结果的价值,需要改进现行方法,提高检测灵敏度。

⒈直接计数法
⑴扫描电镜观察计数
用扫描电镜计数水生细菌是有效的,其技术关键有2点:(1)要能将水样中的细菌全部分离出来;(2)具备区分细菌与非细菌成分的熟练技术。
⑵荧光显微镜观察计数
荧光显微镜观察计数法快捷,从取样到检出只要20—30分钟,而且灵敏性好。操作程序是先固定水样,然后用化学荧光物染色,再真空过滤到不产生荧光的聚碳酸酯膜上,最后在荧光显微镜下观察。吖啶橙色染料(Acridine Orange,AO)是常用染色物质,能与RNA和DNA反应而产生荧光。与其他直接计数技术一样,荧光显微镜观察法不能区分细m.365you.com指尖棋牌_365棋牌金币_http:\\/\\/365棋牌游戏类,分析代谢活性或判断是否处于存活状态。如果由于工作经验不足,将死亡细菌、碎屑物混计在内,则会过高估计活细菌总数。有些研究将AO染色与测代谢活性的方法结合起来,如A()-INT,提高了检测准确性。
直接计数法获得的结果往往较标准平板法高出2个甚至更多个数量级。

⒉改进接种方法
倾倒平板法虽然简单,但缺点也非常明显:(1)尽管要求将培养基的倾倒温度控制在45—46~C,然而热冲击依然存在;(2)平板表层以下的菌落生长慢,而且不便于转种培养;(3)水样体积的限制(<2ml)
实践表明下述两种接种方法的应用效果良好。
⑴均匀涂布接种
首先是制备具有吸附能力的干燥培养基。将15mL已灭菌培养基倒入lOOmm×15mm 或90mm×15mm平皿中,翻转,42℃恒温固化24 h,使水分丧失2~3g后立即使用,或用塑料袋封好在4C储存,有效期不应超过2周。如果需要当日制备并使用,则将25mL培养基倒入平皿中,不加盖,室温(24~ 26℃)下在层流通风柜内干燥,同样使水分丧失2-3g。
将0.1~0.5mL水样均匀涂布到培养基表面的方法有两种:(1)使用长200mm,直径4mm,一端45。弯曲的玻璃棒,人工将样水推开;(2)使用转台,将平皿固定在转台上,启动旋转,前后摆动移液管(止于距边缘0.5cm处),将水样缓慢释放出来。不论采用何种方法,都要保证水样被完全吸收。均匀涂布接种法获得的结果总是不同程度地高出倾倒平皿法。尤其计数海洋细菌时,均匀涂布的平均计数几乎为倾倒法的3倍。
⑵滤膜计数法
由Taylor和Geldreich提出了用滤膜计数水中细菌总数的方法l4],使用培养基命名为rn—sPC,已商业化生产,可在市场上购买到。滤膜法的优势在于可检测大量低浊度水样,尤其适合分析洁净水(< 1-10CFU/mL)。事实上,如果将水样量由lOOmL增至300mL,细菌的检出率明显增加。在对722个水样的检测中,若只取1OOmL水样,则有259例不能检出,但将水样量增至300mL,则其中32 的水样有细菌有检出。
在大多数情况下,滤膜法获得的计数结果高于倾倒平皿法。此外,产色素菌在滤膜上生长速度快,而且易挑出单菌落进行种类鉴定及生化分析。但是,滤膜法检测可能受滤膜质量等因素影响。

⒊调整培养温度和时间
出于肠道卫生学考虑,历史上将培养细菌总数的环境温度控制在37℃ ,后来确定为35℃ 培养48h。大量对比实验表明,35℃ 肯定是最不适宜获得最高菌落数的温度,计数结果不及28℃ 时的14% ,20℃时的20 。鉴于细菌总数用作评价净水效率的价值高于其卫生学意义,很多学者赞同降低培养温度(20℃或28℃),延长培养时间(5~7d),以此促使最大数量的菌落出现在计数平板或滤膜上。细菌总数会随培养时间延长而增加。一般情况下,12~14d可达到最高计数,而在前6天,增长速率最快。对平板计数技术,最快增长发生在前2~4d。温度越高,达到50 最高菌落数所需时间越短。如以12~ 14d最高值为标准,则达到5O 数量,35℃ 需4d,28℃ 需6d,20℃ 需8d。长期培养不适合开展常规检测。建议在尽可能短的时间内完成计数,必要情况下,将已计数平板继续培养,定期观察,记录最大值。

⒋选用替代培养基
目前可利用的替代培养基有高、低营养成分两大类。高营养成分培养基有m—SPC培养基;低营养成分培养基有NWR1琼酯、R2A 培养基、CPS培养基、DP琼脂培养基,Henrici改良培养基等。

三、R2A培养基及其应用

⒈R2A培养基的应用
R2A培养基可用于倾倒平板、均匀涂布和滤膜检测法。由于R2A培养基能促进受损细菌的恢复性再生长,其在20℃ 下培养7d获得的最高菌落数总是高于PCA和m—SPC(表1)。从表中还可看出,R2A均匀涂布法计数结果更高。相对于PCA,细菌在R2A 培养基上的生长速度要慢,形成的菌落要小,在48h内,准确计数困难,因而需要延长培养时间,使菌落生长得足够大,但不会或少融合生长。
R2A培养基适合产色素菌生长。在3~5d内,产色素菌可形成明显的菌落。均匀涂布法计数产色素菌所获得的结果比较理想。耐氯菌在R2A 培养基上生长良好。28℃ 培养5~7d后,生长缓慢的耐氯菌菌落开始出现,其对1.Omg/L的游离余氯的抵抗力很强。将PCA 上生长的菌落挑出,转培养到新配PCA上,则有很多不能再生长。但如果将丙酮酸钠以外的R2A其他组成成分双倍配制,则新的培养基适合分离菌株的转培养,从而有利于进行种类鉴定和生化特征研究。
R2A培养基已成功地用来检测饮用水样、GAC、管道内壁生物膜、污损反渗透膜内异养菌的数量,在可比培养条件下,R2A 计数结果总是最高的,但也不排除由于地理区域差异,水中细m.365you.com指尖棋牌_365棋牌金币_http:\\/\\/365棋牌游戏群不同,R2A培养基上生成菌落数反而减少的情况。

四、提高饮用水中细菌检出率的技术细节考虑
细菌总数是评价饮用水水质的常规检测项目,一些技术细节的规范化处理或改进有助于提高计数准确性,应严格按规程操作,本文不一一赘述。

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